NiNTASepharose6FF的预装柱
产品名称： NiNTASepharose6FF的预装柱
英文名称：
产品编号： YA2411-1*1mL
产品价格： 0
产品产地： 中国 北京索莱宝
品牌商标： solarbio
更新时间： 2025-01-02T09:53:49
使用范围： null
- 联系人 : 索莱宝-龚思雨
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NiNTASepharose6FF的预装柱
Ni NTA Sepharose 6FF的预装柱说明书
货号：YA2411
规格：1*1mL / 1*5mL / 5*1mL / 3*1mL+1*5mL / 5*5mL
保存：2-8℃
产品说明：
Ni NTA Sepharose 6FF（IMAC）是利用Ni2+与蛋白质侧链上的某些氨基酸(主要为组氨酸、半胱氨酸、色氨酸)相互作用而进行分离纯化，适用于His标签蛋白及与Ni2+具有相互作用的生物分子的分离纯化。
特点如下：
a.快速、简单（一步纯化）。
b.使用范围广、操作简单。
c.相对于Ni -TED Beads 6FF来说，结合载量大、试剂兼容性广。
表1：介质性能参数
| 基质 | 高度交联 6%的琼脂糖 |
| 粒径范围 | 45-165µm |
| 平均粒径 | 90µm |
| 结合载量 | 40mg(His 标签蛋白)/ml(介质) |
| pH 稳定性* | 3-12（长期）2-14（短期） |
化学稳定性* |
0.01M 盐酸、0.01M 氢氧化钠（一周） 1M氢氧化钠、70%乙醇(12小时) 2% SDS（1小时） 30% 异丙醇（30分钟） |
| 兼容性 | 所有在 Ni-6FF（IMAC）中正常使用的溶液 |
| 流速 | 600cm/h |
| 操作压力 | ≤0.3MPa |
| 贮存溶液 | 20%乙醇 |
*：此处稳定性指的是在未螯合金属离子时介质的稳定性。
表2：常用试剂兼容性
| 缓冲液 | 0.05M sodium phosphate，pH 7.4、 0.1M Tris-HCl, pH 7.4、 0.1M Tris-acetate, pH 7.4 0.1M HEPES, pH 7.4、 0.1M MOPS, pH 7.4、 0.1M sodium acetate, pH 4 |
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| 变性剂 | 8M Urea、 6M Gua-HCl | |||
| 去污剂 | 2% Triton X-100、 2% Tween 20、 2% NP-40、 2% Cholate、 1% CHAPS | |||
| 还原剂* | 0.005M DTE、 0.005M DTT、 0.02M β-mercaptoethanol、 0.005M TCEP、 0.01M reduced glutathione |
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| 其它添加剂 | 0.5M Imidazole、20% Ethanol、50% Glycerol、0.1M Na2SO4、 1.5M NaCl、0.001M EDTA**、0.06M Citrate |
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*：Ni NTA Sepharose 6FF (IMAC)在使用过程中，允许在样品和纯化溶液中加入低浓度的还原剂，但在不使用时切不可用含有还原剂的溶液长时间浸泡或保存。
**：Ni NTA Sepharose (IMAC)在使用过程中，允许在小体积样品中加入极低浓度的金属离子螯合剂（例如0.001M EDTA），但不得在纯化溶液中加入或者加载大体积含螯合剂的样品。
纯化流程：
1、Buffer 的准备
溶液配制（如果是包涵体纯化，在下述平衡液、洗杂液、洗脱液中添加8M尿素或6M盐酸胍）
平衡液：0.02M PB、0.5M NaCl，调节 pH 7.4，室温保存。
备注：平衡液中NaCl是为了抑制介质的离子交换作用。
洗杂液：0.02M PB、0.5M NaCl、0.02-0.04M咪唑，调节pH 7.4，室温保存。
备注：根据最终使用需求（优先考虑的是纯度，还是收率），在洗杂液中加入0.02-0.04M 咪唑（优先考虑回收率）或者直接在平衡液中加入0.02-0.04M咪唑（优先考虑纯度）。
洗脱液：0.02M PB、0.5M NaCl、0.5M 咪唑，调节pH 7.4，室温保存。
备注：一般情况下，洗脱液中咪唑浓度在0.05-0.25M即可洗脱下目标蛋白。
2、样品准备
上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用结合/洗杂缓冲液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用结合/洗杂缓冲液透析。
样品在上样前建议离心或用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。
备注：蛋白的结合能力随着裂解物类型、目标蛋白性质、流速、pH 变化而变化，低流速常常能增加样本的结合效率。
3、样品纯化
1. 上柱：将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中。再折断下口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。
2. 水洗：用3-5倍柱体积的去离子水冲洗出存储缓冲液。
3. 平衡：使用至少5倍柱床体积的平衡液平衡色谱柱。1ml预装柱推荐流速为0.5ml/min，5ml预装柱推荐流速为2ml/min。
备注：此步骤用于平衡介质，保证介质中的溶液的组分和 pH 与样本一致。
4. 利用泵或注射器上样。
注:样品的粘度增加使得即使上样体积很少，也会导致层析柱很大的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。大量的样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。
- 洗杂：用洗杂液冲洗柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少10-15个柱体积）。
- 洗脱：用洗脱液采用一步法或线性梯度洗脱。一步洗脱中，通常5倍柱体积洗脱液就足够了。梯度洗脱可以用一个小的梯度，例如20倍柱体积或更多，来分离不同结合强度的蛋白质。
- 水洗：依次使用3倍柱体积的平衡液和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4℃保存，防止填料被细菌污染。
4、SDS-PAGE检测
将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用
SDS-PAGE检测纯化效果。
填料清洗
清洗后可以去除一些强结合性物质（例如一些强结合的蛋白、变性蛋白、脂类等），从而达到恢复介质的优良性能（例如载量、流动性、柱效等）。
建议每使用5-10次后进行一次清洗，具体清洗频率需根据纯化的初始样品的洁净度进行调整。
A、用5-10倍柱体积纯化水冲洗。
备注：用于去除洗脱液（使用后直接清洗）或20%乙醇（使用前清洗）。
- 用5-10倍柱体积0.02M Tris-HCl、0.1M EDTA，pH8.0冲洗，再用5-10倍柱体积纯化水冲洗备。备注：用于脱Ni2+
- 用5-10倍柱体积1.0 M NaOH冲洗，静置1.0小时后再用纯化水冲洗至中性。
备注：用于清洗一些聚集在介质上的蛋白沉淀、脂类等物质。
- 用5-10倍柱体积0.1 M NiSO4冲洗，静置0.5小时后再用5-10倍柱体积纯化水冲洗。
备注：用于螯合Ni2+
- 用5-10倍柱体积的20%乙醇冲洗后保存。
备注：备注：20%乙醇可以防止微生物的生长，20%乙醇保存的介质储存在2-8℃。
常见问题
表1：常见问题及解决方案
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
纯化时目标物不与介质结合或结合量较低 |
1.上样量过载 | 降低上样量 |
| 2.上样速度过快 | 降低上样流速 | |
| 3.蛋白或脂类在介质中聚集影响结合 | 及时有效地清洗介质或更换新的介质 | |
| 4.表达条件过于剧烈，His标签被包裹， 不能与介质结合 | 建议做一个空载体作为表达和纯化的对照，确定表达条件是否合适 | |
| 5.初始样品中没有组氨酸标签蛋白 | 通过基因序列或His标签抗体核实 | |
| 6.目标蛋白出现在流穿中 | 目标蛋白没有成功表达或样品和平衡液中pH和组分不正确 | |
洗脱时没有收集到目标物或只收集到少量目标物 |
1.目标物没有与介质结合或结合量较少 | TUNEology 波长可调检测卡盒-->
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